[Jaera hopeana] Inconnu clandestin

Ici est le point de rendez-vous des Cloportes.

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DrPorcellion
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Messagepar DrPorcellion » lundi 12 décembre 2016, 12:00

Si, si, du Sanger :-P

J'utilise un kit d'extraction (ARN en l'occurrence, puis je les reverse-transcris), on lyse juste les tissus au sonicateur (ou à l'azote mais j'aime moins). J'amplifie mon bout de COI avec ces primers, purification. Je refais une PCR avec les mêmes amorces pour préparer le Sanger et j'envoie à la plate-forme de séquençage.

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Messagepar Mazancourt » lundi 12 décembre 2016, 14:21

Je séquence aussi mes bêtes en Sanger au Muséum :)

Pour le BLAST c'est peut-être une contamination, tu as envoyé des produits PCR d'autres bêtes à séquencer en même temps ?
Ou sinon, ce sont les séquences déposées sur GenBank qui ont été mal identifiées, après tout ça s'est déjà vu, et comme il n'y a aucun contrôle...

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Messagepar DrPorcellion » mercredi 4 janvier 2017, 13:29

Je ne pense pas que ça soit de la contamination ... mais je n'ai pas de preuve :mrgreen:
Les erreurs d'identification genbank sont possibles aussi mais là c'est tellement gros (isopode marin/terrestre) que ce n'est pas non plus la piste que je privilégie.
J'ai un collègue qui a eu le même type de problème avec son blast... je garde mes soupçons sur la séquence en elle même (insert mito dans le noyau ?! pas la même portion du gène ?) mais je n'ai pas le temps de creuser l'histoire pour le moment. Si j'ai du nouveau je vous dirai bien-sûr.

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Messagepar entonantes44 » samedi 14 janvier 2017, 14:02

Cela m'étonne un peu aussi. Je n'ai sans doute pas assez de recul pour bien analyser. Par contre, ce qui pourrait se faire quand tu auras du temps c'est de reconstruite un arbre à partir de tes séquences et voir si cela peut être cohérent. Cela te donnera une idée de la qualité de tes séquences.
C'est intéressant en tout cas, merci de nous avoir proposer ces premières séquences :bienvu: . C'est quoi le nom de vos plateformes de séquençages? cela doit quand même être du Sanger nouvelle génération à mon avis, pas la méthode originelle.
Brendan

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Messagepar Mazancourt » samedi 14 janvier 2017, 18:26

Chez nous, on passe par l'entreprise Eurofins :)

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Messagepar entonantes44 » samedi 14 janvier 2017, 19:03

D'accord, oui moi aussi je passais par eux. C'est donc bien un technique encore en cours, couplée à l'électrophorèse capillaire. Sanger : deux prix Nobel, c'est correct :mrgreen:
Brendan

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Messagepar guillaume » lundi 16 janvier 2017, 9:47

Petite question bête: Jaera hopeana est-il bien dans la base de donnée des organismes séquencés (mitochondrial) pour le blast? Je ne trouve pas la sequence de la cox1 sur ncbi...

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Messagepar entonantes44 » lundi 16 janvier 2017, 22:39

Non, il n'y est pas. Ou alors ce serait une surprise. Mais par contre il y a quelques isopodes et Benjamin aurait bien voulu avoir un joli petit arbre propre sur lequel positionner sa séquence. Mais là c'est un peu étonnant, cela sort pour un Amphipode alors qu'il y a de l'isopode et avec un résultat étonnant!
Brendan

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Messagepar guillaume » mardi 17 janvier 2017, 9:43

C'est effectivement très étonnant 8-O

Par curiosité j'ai fait un alignement de différentes espèces de Janiridae et de Melitidae, en excluant Melita palmata (au cas où l'erreur vienne de Genebank), puis une reconstruction de la phylogénie avec le logiciel Mega7.

Voilà le résultat (SEQ = séquence de notre spécimen):

Cela confirme que le problème ne vient pas de Genbank...

Image
Guillaume JACQUEMIN : France : Les Portes-en-Ré : 17880 : 09/10/2015
Altitude : NR - Taille : 1 mm
Réf. : 176948

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Messagepar entonantes44 » mardi 17 janvier 2017, 21:58

C'est malin, c'est propre, j'aime :bienvu: .

Je n'avais pas trouvé toutes ces séquences je dois t'avouer.

Cela précise notre problème. Qu'en dis-tu Benjamin?
Brendan


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